手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿可出现中枢神经、呼吸系统损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型（EV71）和A组柯萨奇病毒（CoxA）、埃可病毒（Echo）的某些血清型。但重症手足口病例多由EV71感染所致。肠道病毒传染性强，隐性感染比例大，传播途径复杂，传播速度快，易引起暴发或流行。
2008年我省发生了较严重的手足口病疫情，全年共网络报告26454例，死亡26例，发病率达98.3/10万，严重威胁群众特别是少年儿童的生命安全。为进一步加强我省手足口病监测工作，为制定防治策略和措施提供科学依据，特制订本方案。
一、监测目的
1、了解我省不同地区的手足口病的病原谱及其动态变化。
2、根据病原监测结果，科学分析、判断疫情的发展趋势及严重程度，为制定针对性的措施提供科学依据。
二、监测定义
（一）监测病例定义
1、手足口病临床诊断病例
急性起病，发热，手掌或脚掌部出现斑丘疹和疱疹，臀部或膝盖也可出现皮疹。皮疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；口腔粘膜出现散在的疱疹，疼痛明显。部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。重症病例：1.有手足口病的临床表现的患者，同时伴有肌阵挛，或脑炎、急性迟缓性麻痹、心肺衰竭、肺水肿等。2. 手足口病流行地区的婴幼儿虽无手足口病典型表现，但有发热伴肌阵挛，或脑炎、急性迟缓性麻痹、心肺衰竭、肺水肿等。
2、发热伴出疹症候群病例
发热伴出疹，发热≥37.5℃，持续一天以上，伴有全身或局部的皮肤或粘膜出疹，皮疹特点为口腔粘膜、手、足部位丘疹水疱样损害。
（二）聚集性发病或暴发疫情定义
在一个自然村或一个居委会一周内出现5例或以上手足口病病例，或一个班级和家庭一周内出现2例或以上手足口病病例。
三、监测内容和方法
（一）监测点选择
1、监测地区：阜阳、亳州、蚌埠、合肥、芜湖。
2、监测哨点医院：阜阳市传染病医院、亳州市人民医院、蚌埠市第一人民医院、合肥市第一人民医院、芜湖市第二人民医院为哨点医院，监测科室可包括儿科、感染科和皮肤科等。各市可根据实际情况，增加其他符合条件的医院作为哨点医院。
（二）监测点工作内容
1、标本采集对象
为手足口病临床诊断病例、手足口病重症病例和聚集性发病或暴发疫情病例。如未发现上述病例，则采集发热伴出疹症候群病例。市疾控中心负责对所有的采样对象进行流行病学个案调查。个案调查表见附件1。
2、标本采集和保存
监测哨点医院负责每周采集至少5例相关病例咽拭子标本和疱疹液标本，如采集不到咽拭子标本和疱疹液标本，则采集粪便标本或肛拭子标本；采集样本时必须填写采样登记表（见附件2）。
采集后由哨点医院统一保存（－20度冰箱冻存），每周一送当地市级疾控中心。采集和保存标本方法见附件3。
3、病原检测、鉴定
辖区市级疾病预防控制中心负责进行病原检测、鉴定，具体方法见附件4。
发生暴发疫情时，市疾控中心对新发病例和搜索病例，应在抗生素应用前，尽早采集5～10份咽拭子标本，进行病原检测、鉴定，如不到5份，则所有病例全采。在暴发疫情控制结束7日内，相关实验室采样、检测和分离结果，随疫情控制总结报告上报省疾控中心。
4、菌株的管理
依据《中华人民共和国传染病防治法》、《中国医学微生物菌种保藏管理办法》及《病原微生物实验室生物安全管理条例》的规定与要求对分离到的手足口病病原进行保存、运送与管理。各市疾控中心检测出的手足口病阳性标本，应送交省疾控中心保存，并提供相关采样登记表。
（三）专题调查与监测
省疾控中心将适时开展密切接触者和自然人群的专题调查和监测。
四、监测系统的组成与职责
1、监测系统由省卫生厅和相关市级卫生行政部门、安徽省疾病预防控制中心及各相关市级疾控中心和监测哨点医院组成。
2、省卫生厅负责全省的监测工作，各相关市级卫生行政部门负责组织开展本辖区内监测工作，并提供所需监测经费，保证监测工作顺利开展。省卫生厅对选择的监测点提供经费补助，监测点所在地应给予配套经费支持。
3、安徽省疾病预防控制中心负责监测方案制订、组织考察、确定全省监测点布局、人员培训、技术指导和系统评价，并加强监测工作实施的检查和质量控制。
4、各市级疾控中心负责具体实施。各监测哨点医院在当地卫生行政部门的统一领导下，配合当地市级疾控中心开展各项监测工作，完成就诊病例的标本采集和协助个案调查工作。
五、数据收集、分析和反馈
（一） 数据收集内容：
1、流行病学个案调查表和个案数据库
2、病例采样登记表
3、分离鉴定月报表
4、暴发疫情调查报告
（二）数据收集流程
监测点实施监测内容，各种数据收集、分析以及各种标本的采集
市疾病预防控制中心
省疾病预防控制中心
（三）统计分析内容和指标
1、病例情况：病人年龄、性别、职业和时间、地理分布等。
2、实验室监测结果
3、聚集性发病或暴发疫情数量、分布和特征
（四）数据的报告和反馈
市级疾控中心每月4日前将上月检测结果以电子数据方式上报至安徽省疾病预防控制中心急性传染病防治科。安徽省疾病预防控制中心向各地反馈复核结果，并负责完成年度全省监测总结报告。
电子信箱地址：wjb0386@sina.com
传真：0551-2862935
电话：0551-2863087
六、监测质量控制
1、方案的起草和论证：省卫生厅组织相关专家起草监测方案，并广泛论证。
2、培训：在监测工作开始前，由安徽省疾病预防控制中心组织统一培训。
3、病原核实：安徽省疾病预防控制中心微生物检验室对市级疾病预防控制中心送交的阳性标本进行鉴定。
4、技术资料档案管理，原始记录，总结等。
七、附件
附件1 手足口病流行病学个案调查表
附件2 手足口病采样登记表
附件3 手足口病标本采集和保存方法
附件4 手足口病标本病原检测和鉴定方法
附件1 手足口病流行病学个案调查表
编号：□□□□□□-□□□□ （按照国家标准编码：省编码＋市编码＋县编码＋病例序号） 调查单位：_______________ 是否报传染病卡 （1）否 （2）是 卡号□□□□□□□□
一、一般情况
１．患者姓名
２．性别
３．出生日期 年 月 日
４．职业 （1）托幼儿童 （2）散居儿童 （3）学生 （4）其他
５．工作单位（就读学校或托幼机构）
６．监护人姓名： 与患儿关系（父、母、祖父母、外祖父母、其他）
联系电话：
７．现住址 市 乡（镇、街办） 村（居） 号
8 ．身高 厘米 体重 公斤
9 ．有无既往病史（1）无 （2）有，主要疾病
二、发病及就诊情况
１．发病日期 年 月 日
２．初诊日期 年 月 日；初诊单位 （省级/市级/县级/乡级/村级）
初步诊断：_______________________________
３．临床症状：（１）轻型 （２）重型
４．是否住院治疗（1）否 （2）是 ，如住院，则：
4.1所住医院____________________
4.2入院日期 年 月 日 时
4.3入院诊断
4.4出院日期 年 月 日
4.5出院诊断
5．预后：（1）痊愈（2）好转（3）未愈（4）死亡，死亡日期 年 月 日 时
（5）其他 ；
后遗症 ①无 ②有，
三、临床情况
（一）临床表现
1．发热 （1）无 （2）有，最高 ℃，发热持续时间 天
2．皮疹（1）无 （2）有，如有，部位 ①手 ②足 ③臀 ④其他：_________________
3．口腔粘膜上有无出现溃疡/疱疹 （1）无 （2）有
4．呼吸系统症状 （1）无 （2）有，如有请选择
①流涕 ②咳嗽 ③咽痛 ④ 其他：__________________________
5．消化系统症状：（1）无 （2）有，如有请选择
①恶心 ②呕吐，如有，呕吐方式：①喷射性 ②非喷射性 ③不详
③腹痛 ④腹泻 ⑤ 其他：_______________
6．神经系统症状：（1）无 （2）有，如有请选择
①头痛 ②精神异常 ③嗜睡 ④肌体无力 ⑤ 肢体抖动 ⑥意识障碍 ⑦昏迷 ⑧惊厥
7．心律失常：（1）无 （2）有
8．颈项强直：（1）无 （2）有
9．巴氏症：（1）无 （2）有
10．克氏症：（1）无 （2）有
11．布氏症：（1）无 （2）有
12．腱反射：（1）正常 （2）亢进 （3）减弱
13．肌张力：（1）正常 （2）亢进 （3）减弱
（二）辅助检查
1．有无血常规检测：（1）无 （2）有，有则：
WBC（ ×104/L），N（ %），L（ %）
2．有无脑脊液检测：（1）无 （2）有，有则
压力（ Pa），外观（正常/异常），细胞记数（ 个），蛋白（ ）糖含量（ ）
3．有无X线检查：（1）无 （2）有，表现为
4．心肌酶谱：（1）无 （2）有，肌钙蛋白酶 肌红蛋白酶
四、标本采集情况
标本类型 送检标本编号 采样日期 是否
冷藏 标本量 收样
日期 检测
日期 实验结果
RT-PCR RD HEp-2 中和抗体滴度
咽拭子
血
清 急性期
恢复期
粪便标本
脑脊液
疱疹液
注：送检标本编号为“病例编号+标本类型”，其中“T”为咽拭子代码， “S1”为急性期血清代码，“S2” 为恢复期血清代码，“F”为粪便标本代码，“CSF”为脑脊液代码，“H”为疱疹液代码。
调查人_______________ 调查日期： 年 月 日
附件2 手足口病例标本送检登记表
编号：□□□□□□-□□□□ （按照国家标准编码：省编码＋市编码＋县编码＋病例序号）
一、一般情况
1.1患者姓名 ，若为14岁以下儿童，家长姓名
1.2性别
1.3出生日期 年 月 日（阴/阳历）
二、发病情况
2.1发病日期 年 月 日
2.2初诊日期 年 月 日
2.3初步诊断：_______________________________
2.4临床症状：（１）轻型 （２）重型
2.5是否住院 （1）是（2）否
三、标本采集情况
标本类型 送检标本编号 采样日期 是否冷藏 标本量 收样日期 检测日期 实验结果
咽拭子
粪便标本
疱疹液
采样人： 采样单位： 送样人：
★编号规则
标本类型：“T”为咽拭子代码， “F”为粪便标本代码， “H”为疱疹液代码。 具体编号规则为
“地区代码/年份/病例编号(001~999)/标本类型”
各地市编号代码如下：合肥HF；蚌埠BB；芜湖WH；阜阳FY；亳州BZ
例如：合肥2009年第7号病例的咽拭子标本\粪便标本\疱疹液标本编号分别为 HF09007T \ HF09007F \ HF09007H
附件3 手足口病例标本采集和保存方法
一、标本采集和保存方法
（一）粪便标本
采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（二）咽拭子标本
采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有1~3ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
（三）疱疹液标本
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有1~3ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
二、标本采集注意事项
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值，但对于不同血清型的肠道病毒，脑脊液中的病毒分离率是大不相同的。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。
附件4 手足口病标本病原检测
一、手足口病的实验室检测原则和程序
手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断。
很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD细胞（对CA16和EV71敏感）、HEp-2细胞（对某些柯萨奇B组病毒敏感）等，联合使用上述两种或更多细胞（如Vero细胞）有助于分离到更多的肠道病毒。
当无法进行病毒分离或得不到适用于病毒分离用的标本时，血清学检测可以为肠道病毒的感染提供一个间接的证据。一般用急性期血清与恢复期血清的检测结果进行比较，抗体滴度呈四倍或以上增高证明有急性感染。但是，无症状的肠道病毒感染也是常见的，所以对检测结果的解释要慎重一些。
为了提高检测速度，也为了辅助中和实验法进行毒株鉴定，最近很多实验室都使用分子生物学方法。目前，用分子生物学方法对肠道病毒进行定型还没有统一的标准，而且要根据检测目的选择使用适用的方法。
二、实验室检测操作流程
（一）病毒分离
1.试剂配置
（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表
生长液（GM） 维持液（MM）
Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml
L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml
胎牛血清 10.0ml 2.0ml
7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml
P.S溶液*(青霉素及链霉素) 1.0ml 1.0ml
（2）粪便标本的处理液
完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500μg/ ml。
2．病毒分离细胞系
许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CA16）生长。
对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CA16的标本均需接种到以下两种细胞系：
RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。
HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。
3．标本的处理
（1）粪便标本的处理
操作步骤：
1.1在离心管上标记标本号；
1.2每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；
1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；
1.4剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；
1.5确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；
1.6在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；
1.7在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）；
1.8一管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另一管存于4~8℃以备接种。
（2）疱疹液标本的处理
疱疹液标本通常直接用于病毒分离。
（3）脑脊液标本的处理
脑脊液标本通常直接用于病毒分离。
（4）咽拭子标本的处理
咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
4．接种和观察（病毒分离）
（1）显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成；
（2）倒掉生长液（GM），换上1~1.2ml的维持液（MM）；
（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；
（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；
（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃（对于AHC标本的病毒分离，尤其是EV70的分离培养，强烈建议降低培养温度，一般可为34~35℃）；
（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；
（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+~4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%~50%; 3+, 50%~75%; 4+, 75%~100%）；
（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代。同一病例的二次传代的病毒分离物可以放到一起用于进一步的鉴定；
（9）第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；
（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定。
（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；
（12）盲传2代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；
（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应。
（14）几个概念：
A：毒性反应：如果在接种后1~2d内细胞快速地调亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。
B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。
C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7~10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。
5．病毒分离结果解释：
RD细胞支持HFMD的主要病原体——CA16和EV71的复制，CA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。
若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其它可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。
从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围患同样疾病者中也检出相同的病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊断的参考价值。
（二）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
方案一 从组织中或咽拭子中提取病毒RNA进行PCR试验
1．RNA提取
可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA；
（1），向一支1.5ml离心管中加入560μl的AVL缓冲液（含Carrier RNA）；
（2），再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15s；
（3），室温下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬时离心；
（4），加入560μl纯酒精，充分混匀至少15s，瞬时离心；
（5），小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中（试剂盒附带），将QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（6），弃去收集管中的液体，重复第6步骤；
（7），弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW1缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（8），弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW2缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（9），弃去收集管中的液体，13000 rpm再次离心1min；
（10），将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；
（11），向膜上加入40μl的EB缓冲液，然后室温下静置2~5min；
（12），在离心机中以8000 rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。
2．RT-PCR扩增
（1）引物序列合成
1）人肠道病毒（包括EV71、CA16）核酸检测通用引物序列：
PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`
PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`
EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
3）CA16核酸检测引物序列：
Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
（2）实验设计
1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。
2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。
A：阳性对照：无感染性的对照RNA。
B：细胞对照：使用未接种病毒的细胞悬液，最好使用与扩增病毒所用的细胞类型与代数相同的细胞。每一次实验设2个细胞对照。
C：试剂对照：用去离子水代替标本。
（3）RT-PCR扩增
1）在冰面上融化病毒标本和各种PCR试剂；
2）配下列试剂主溶液：
10×PCR Buffer•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5.0μl
dNTPs（2.5mM each）••••••••••••••••••••••••••••••••••••2.0μl
上游引物（0.1μg/μl）•••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl
下游引物（0.1μg/μl）••••••••••••••••••••••••••••••••••••1.0μl
RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）••••••••••••••••••••••0.5μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）•••••••••••••••••••••••••••0.5μl
AMV逆转录酶（10U/μl）••••••••••••••••••••••••••••1.0μl
模板RNA•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3.0μl
RNase Free dH2O••••••••••••••••••••••••••••••••••••36.0μl
50.0μl
3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：
42℃••••••••••••••••••••••••45min
95℃••••••••••••••••••••••••3min
95℃••••••••••••••••••••••••20s
45℃••••••••••••••••••••••••25s ×32个循环
72℃••••••••••••••••••••••••30s
72℃••••••••••••••••••••••••10min
4℃••••••••••••••••••••••••Soak
方案二 从组织中或咽拭子中提取病毒RNA进行PCR试验
1．RNA提取
可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Rneasy Mini Kit（CAT： 74104）：
1）、取一无菌的1.5 ml EF管加入500 ul Bffer RLT；
2）、向每管中加入临床标本悬液200 ul，充分混匀；
3）、每管标本中分别加入5 ul β-巯基乙醇，混匀后依次加入600 ul 70%乙醇，充分混匀；
4）、从kit中取出带滤柱的2 ml收集管，打开包装将其做好标记。取步骤3）中的混合液600 ul加入滤柱中，12000 rpm离心15s，丢弃收集管中的离心液；
5）、滤柱仍放回收集管中，将步骤3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000 rpm离心15s，丢弃收集管中的离心液；
6）、向滤柱中加入700 ul的Buffer RW1液，12000 rpm离心15s；
7）、从kit中取出干净的2 ml收集管，将离心后的滤柱转移到新的收集管上，向滤柱中加入500 ul Buffer RPE液，12000 rpm离心15秒。
8）、丢弃离心管中的离心液，再向滤柱中加入500 ul Buffer RPE液，13000~14000 rpm离心2 min；
9）、将滤柱转移到干净的1.5 ml EP管中，向滤柱中加入40 ul的Rnase-free water，室温静置5 min；
10）、12000 rpm离心1min，收集离心液即为病毒提取RNA，立即做以下实验或用-20℃保存。
2．RT-PCR扩增
（1）引物序列合成（同方案一）
（2）实验设计（同方案一）
（3）RT-PCR扩增
1）在冰面上配制各种PCR试剂；
2）配下列试剂主溶液：
主要试剂 每个反应用量
5× Green Buffer 10ul
MgCl2(25mM) 4ul
dNTP (10mM) 1ul
Forward Primer (20 uM) 1ul
Reverse Primer (20 uM) 1ul
TaqE （5U/ul） 0.5ul
AMV (promega)（10U/ul） 1ul
RNase Inhibitor（50U/ul） 1ul
Rnase-free water 20.5ul
总体积 40ul
充分混匀上述混合液，分装到PCR管，每管 40ul
然后分别加入标本的模板RNA 10ul 后 反应总体积 50ul
注：同时做好阴性对照和阳性对照；
3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应程序如下：
42℃ 45 min
94℃ 5 min
94℃ 15 s
50℃ 30 s ×30个循环
72℃ 30 s
72℃ 7 min
4℃ Soak
方案一或方案二所获得的PCR产物用以下步骤进行分析
1．电泳分析
1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；
2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；
3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；
4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35~40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；
5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；
6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，——注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用；
7）在蒸馏水中涮一下凝胶；
8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。
2．结果解释
通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。
RT-PCR实验结果解释表
待检标本RT-PCR结果 鉴定结果
所有引物（－） 非肠道病毒（NEV）
EV（＋），EV71（－），CA16（－） 非EV71、CA16的其它肠道病毒
EV（＋），EV71（＋），CA16（－） EV71
EV（＋），EV71（－），CA16（＋） CA16
三、生物安全
根据2006年1月11日卫生部制订的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒 71型和目前分类未定的其它肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。
操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。
灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。
所有操作应遵守国家相关法律法规。
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